FLAER多參數檢測PNH克隆的影響論文

時間：2024-06-14 10:03:56 論文范文我要投稿

　　陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性克隆性造血干細胞疾病，其發病機制主要是由于體細胞X染色體上的PIG-A基因突變，導致血細胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨合成障礙，錨連接蛋白缺失。傳統的診斷方法主要有蔗糖溶血試驗、酸溶血試驗、尿含鐵血黃素試驗，但這些方法敏感性、特異性差。近些年來，通過流式細胞儀檢測CD55、CD59已經成為診斷PNH的常規方法，特別是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH 診斷過程中被認為是一個優于CD55 的指標。熒光標記的無活性嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體(FLAER)可以特異性的與GPI錨連蛋白結合，經流式細胞儀檢測，其特異性和敏感性較傳統方法更好。PNH、再生障礙性貧血(AA)和骨髓增生異常綜合征(MDS)均為骨髓衰竭性疾病，具有相似的發病機制和臨床表現，早期鑒別診斷常很困難。本文聯合FLAER、CD45、CD15、CD24 多參數檢測粒細胞PNH克隆以及CD59檢測紅細胞PNH 克隆，旨在有效提高PNH克隆檢測的敏感性、特異性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鑒別診斷，現報道如下。

FLAER多參數檢測PNH克隆的影響論文

　　1 資料與方法

　　1.1 一般資料所有病例均來自于本院血液科連續48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，診斷均符合血液病診斷及療效標準;MDS患者11例，符合2008年WHO診斷分型標準。對照組15例均為巨幼細胞性貧血患者。

　　1.2 儀器與試劑 FACSAria型流式細胞儀，溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24試劑和均購自BD公司，FLAER試劑購自加拿大Protox Biotech公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 外周血紅細胞CD59檢測取EDTA 抗凝全血100μL，經PBS洗滌后稀釋于1.5mL的PBS中，取100μL加入CD59-PE單抗20μL，4℃避光孵育30min后，1 000r/min離心5min，棄上清，用2mL PBS液洗滌2遍，重懸于1mL PBS液中上機檢測，用流式細胞儀測定CD59細胞的表達率。

　　1.3.2 外周血粒細胞FLAER檢測取EDTA抗凝全血100μL，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗體各20μL，避光孵育30min后，加入2mL溶血素，室溫下避光10min，溶血完全后1 000r/min離心5min，棄上清，用2mL PBS液洗滌2遍，重新懸于500μL的PBS液中液上機檢測，用流式細胞儀測定FLAER的表達率。

　　1.4 統計學處理采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗和Mann-Whitney U 檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 臨床特征 PNH患者9例，男6例、女3例，年齡16～60歲，中位年齡30歲;AA患者13例，男5例、女8例，年齡7～63歲，中位年齡38;MDS患者11例，男5例、女6例，年齡41～72歲，中位年齡53歲，其中RCMD 1例，RCUD 6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-綜合征1例;對照組15例，男6例、女9例，年齡19～61歲，中位年齡34歲。

　　2.2 不同方法對PNH 患者檢測的比較 PNH 組患者FLAER缺失率和CD59缺失率分別為(70.07±28.77)%和(38.51±29.15)%，顯著高于對照組、AA組、MDS組，差異有統計學意義(P<0.05)。FLAER檢測結果明顯高于CD59檢測，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率為7.8%，FLAER缺失率為88.1%;另一例CD59缺失率為5.5%，FLAER缺失率為23.2%。

　　2.3 不同方法對非PNH 患者檢測的比較各組中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差異無統計學意義(P>0.05)，表明在非PNH組中FLAER和CD59檢測無顯著差異。對照組中FLAER缺失率為0.0%，特異性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA 患者中5例檢測出FLAER缺失，其中4例檢測出CD59缺失，1例未檢測出;11例MDS患者中3例檢測出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率為0。結果說明FLAER檢測比CD59檢測更為敏感，特異性更好。

　　3 討論

　　到目前為止，已經發現了20多種蛋白在PNH 患者血細胞表面表達缺乏，其中紅細胞膜上衰變加速因子(CD55)和反應性溶血膜抑制物(CD59)的缺失被認為是引起PNH 病理生理的主要原因。紅細胞數目多、抗體表達強是靈敏度檢測最好的目標細胞。尤其是在一些粒細胞減少的疾病中如AA、MDS，紅細胞檢測尤為重要。同時，通過比較紅細胞和白細胞的數值，可以給臨床提供更多信息。CD55分子在紅細胞上表達較低，而CD59分子的熒光染色強且均一，近些年來已成為PNH診斷的“金標準”。然而，越來越多的研究發現檢測紅細胞CD59表達對PNH 的診斷有一定的局限性。

　　本研究發現，在PNH組的兩例患者中，一例CD59缺失率為5.5%，另一例CD59缺失率為2.9%，而FLAER缺失率分別為23.2%和47.7%。可能是由于患者正處于疾病的活動期，接受輸血治療，影響了紅細胞CD59的表達，導致CD59表達出現假陽性。有研究表明，在小細胞低色素性貧血時，病人的紅細胞膜表面的CD59表達均有降低，但粒細胞是正常的，若只檢測紅細胞的CD59會造成其表達假陰性。此外，正常細胞衰老時表面分子CD59還有可能自發丟失，均可導致檢測值偏離事實。隨著技術不斷進步，人們研究出了FLAER 技術，FLAER是Alexa-488標記的無活性的嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體，可以特異性地與GPI錨鏈蛋白結合，在所有具有GPI錨連蛋白的粒細胞上均有特異性表達，不會因不同細胞表達GPI錨鏈蛋白的多少和種類不同造成誤差。由于FLAER能直接檢測GPI蛋白，有助于識別真正的PNH 和免疫性血細胞減少癥，明確真正的GPI陰性細胞。本研究中對照組FLAER檢測缺失率均為0，與CD59相比檢驗結果更具有特異性;在PNH組中，FLAER的缺失率顯著高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止門內出現污染細胞最好的抗體。如果門內污染了少量的CD24陰性表達的細胞群，可能會被誤認為是小的PNH 克隆，而FLAER 與CD24一起使用可以提高PNH檢測的準確性，CD24/FLAER雙陰性細胞群才是真正PNH克隆細胞群。FLAER多參數檢測要求外周血標本采集后必需及時送檢，否則會導致粒細胞存活率下降，細胞非特異性染色增強，影響檢測效果。這在一定程度上影響了FLAER在臨床上的應用。PNH 克隆的檢出對于MDS和AA的臨床表現、治療及轉歸有重要意義。部分具有PNH 克隆的AA患者對免疫治療效果更好，即使小于0.1%的克隆也會影響治療效果。

　　對于檢測出少量PNH克隆的AA患者，需監測PNH克隆數的變化，因為患者有可能發展為溶血性貧血。在本研究中，PNH 與MDS的關系只局限在低危MDS中，表現為血細胞減少，骨髓增生低下;遺傳學異常發生率低，臨床過程惰性進展，更多地表現為骨髓衰竭的特點。AA 組、MDS 組中FLAER的缺失率均大于CD59的缺失率。由于AA和低增生性MDS的鑒別十分困難，但到目前為止還沒有報道MDS的患者進展為PNH，監測PNH 克隆對于這兩種疾病的鑒別具有一定的意義。AA、MDS患者中檢測出的PNH 克隆常常很小，CD59檢測不易測出。在這兩組中各有1例患者CD59缺失率為0，而FLAER表達均有缺失，缺失率分別為4.2%、2.9%。FLAER檢測更敏感，與CD59相比靈敏度更高。由于AA、低增生性MDS和PNH 均屬于骨髓衰竭性疾病，具有相似的發病機制、臨床表現和生物學特性，三種疾病之間的鑒別很困難。FLAER檢測與CD59相比靈敏性和特異性更高。能夠早期提供更為靈敏、特異的PNH 克隆依據，在臨床癥狀不典型、診斷不明確的疑似PNH患者，輔以FLAER檢測有助于早期確診或除外診斷。因此，FLAER高靈敏度檢測PNH 克隆對這三種疾病及疾病之間的診斷鑒別及了解臨床過程、預后及轉歸具有一定的意義。

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