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種新型的基因開關RU486誘導調控系統
畢業論文1
種新型的基因開關—RU486誘導調控系統
小星 尤圣武 彭章龍 于布為
上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院麻醉科
隨著基因治療研究的不斷深入,目的基因的精確表達已經成為首要問題.由
于解決上述問題最好的方法就是擁有1系列復雜嚴密的基因調控系統,所以研究
者們1直在尋求1種高效可靠的誘導調控體系,而RU486誘導調控系統就是目
前找到的較好的1種.近10年來這1系統的研究已很廣泛,它的結構也有幾次大
的改進,現就此予以綜述.
RU486調控系統的結構
1 RU486調控系統的基本結構
RU486調控系統是1994年被Wang等[1]提出的,它由嵌合調控子反式作用
調控區和目的基因區兩部分組成.反式作用調控區含有任意啟動子控制下的嵌合
調控子(chimeric regulator, GLVP),后者是1種嵌合型的可誘導轉錄因子,它包
括酵母轉錄因子Gal4的DNA結合區(Gal4DBD),單純皰疹病毒蛋白VP16激
活區(VP16AD)和PR-891突變體改良后的C末端配體結合區(PRLBD-891)
3部分.目的基因區是指在最小啟動子(TATA盒或胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動
子tk)和4個Gal4 DNA結合區串聯體(p17×4)調控下的目的基因,如圖1.
圖1 RU486調控系統的結構示意圖
在GLVP中,Gal4DBD 代替了孕酮受體的DNA結合區,從而避免了任何
激活內源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4 DBD在哺乳動物細胞中不
中華麻醉在線 http://www.csaol.cn 2007年9月
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存在,目前也沒有發現任何哺乳動物的靶基因可以被Gal4激活,所以這1調控
子只會調控目的基因的表達,而不會影響任何內源基因[1].PR-891是指野生型孕
酮受體在891位點平頭切斷造成的突變體,因此其不能與孕酮受體激活劑R5020
結合,但卻可以與抗孕酮片RU486結合,從而在RU486存在時激活孕酮受體介
導的基因.這可能是由于PR-891比野生型受體少42個氨基酸,而孕酮結合位點
屬于缺失的下游內,RU486結合區則位于上游位置[2].這就避免了給予RU486
時,激活內源性孕酮受體誘導其它基因引起1系列的細胞反應.并且由于反式作
用調控子是1種嵌合型的可誘導轉錄因子,所以它不再與孕酮反應元件(PREs)
或糖皮質類固醇應答成分(GREs)結合[3],干預孕酮受體介導的轉錄,取而代
之的是在RU486作用下,這1調控子僅僅與目的基因區的Gal4DBD結合,并激
活目的基因轉錄表達[2].由于PRLBD-891的轉活能力較差,而VP16AD,即VP16
的 C末端為酸性,可以直接與轉錄起始復合物中的轉錄因子TFIIB,TATA結合
蛋白(TBP)和TBP輔助因子TAFII40相互作用,具有很強的轉活功能.
在目的基因區內,啟動子有兩種:胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(tk)和腺
病毒E1b基因中僅僅包含TATA盒的最小啟動子.Tsai[2]等使用氯霉素乙酰轉移
酶(CAT)作報告基因對2者進行比較發現,p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT
轉染時CAT基礎活力明顯要低1些;而給予RU486后,前者的CAT效能可達
大約50倍,后者僅有10~15倍.這可能是由于tk啟動子中含有GC和CAAT盒
等序列,從而使轉錄效能較大.所以TATA盒啟動子結構應用于要求目的基因的
基礎表達很低時,而在基礎活力稍高能夠耐受,要求轉錄效能很大時應使用tk
啟動子結構.對于p17x4,Gal4 DNA結合區的4個串聯體則在這1系統中可以
提供最大的轉錄效能.
2 RU486調控系統的結構改進
為了使RU486調控系統將來能夠應用于人類的基因治療,降低細胞毒性和
免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成員――人的p65激活區(286~550)
替代VP16激活區,構建出新的RU486反式作用調控區(GLP65),以減少VP16
激活區可能帶來的免疫反應.他們發現使用TATA盒啟動子啟動目的基因時,在
沒有RU486的情況下,GLP65的基礎活力明顯低于GLVP;給予RU486后兩個
調控子均表現出配體劑量依賴性的目的基因表達,這時GLVP組目的基因的表達
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更多,不過由于GLP65的基礎值很低,所以RU486給予時,目的基因的表達倍
數會更高.tk做目的基因啟動子時,上述兩種RU486系統則不管是否給予配體,
兩者的作用相當.所以在使用GLP65時,最好選用TATA盒啟動子作為目的基
因的啟動子.
另外,Mark等[4]在反式調控區與目的基因區之間插入小雞β-球蛋白5'端區
域作為絕緣子(INS)將2者分隔,使目的基因在沒有RU486的情況下不受調控
系統的調節而產生表達.但是他們發現在活體大鼠模型,沒有RU486表達,有
無絕緣子都不會有目的基因的表達;但是HELA細胞水平上,不含絕緣子者的
目的基因則會有較少的表達,而含絕緣子者沒有.
2 RU486調控系統的激活
RU486調控系統的激活過程與甾體類激素被其配體激活相似.反式作用調
控子可以在不同的組織定向啟動子作用下,在各自靶向的組織或細胞進行表達.
當存在RU486時, RU486與PRLBD-891相結合,促使反式作用調控子發生構
象變化形成2聚體而激活,激活的反式作用調控子與目的基因上游的Gal4 DNA
結合區4聚體結合,從而啟動目的基因的表達,如圖2.反之,在沒有RU486
的情況下,由于反式作用調控子的構象不會發生變化,所以RU486調控系統不
能被激活,即目的基因不能轉錄表達.這樣,RU486調控系統便可根據RU486
的量及給予時間,對目的基因的表達水平及其表達時程的長短進行控制[2].
圖2 RU486調控系統激活示意圖
3 RU486調控系統的特點
1. 調控子的激活依賴于RU486的給予.在沒有RU486的情況下,調控子所表
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達的蛋白沒有毒性,也不傳遞表型,調控子不能激活目的基因的表達.只有
給予RU486激活調控子后,目的基因才會表達蛋白.
2. RU486調控系統在轉錄水平調控目的基因的表達,所以可以直接控制后者的
表達.
3. RU486給予量很小,僅僅能夠激活調控子,并不能抑制內源性孕酮受體或糖
皮質激素受體的功能.眾所周知,RU486作為孕酮和糖皮質激素的拮抗劑時,
它的濃度范圍須達微克分子級,所以在臨床使用中RU486作為流產藥物的
劑量應達600mg或10mg/kg.然而,在RU486調控系統中的RU486只需很
少的濃度就可使目的基因表達.Wang等曾做RU486的濃度對照實驗發現,
當RU486濃度僅有0.1nmol/l時即可誘導目的基因的表達,并且系統達到最
大活力時的濃度也僅須1nmol/l,這1劑量要比產生內源拮抗作用的濃度低
1000倍[1].
4. 調控過程是可逆的,且其使目的基因大量表達.RU486停藥后目的基因表達
停止,RU486的重復給予也會重復誘導目的基因的表達.
5. RU486調控系統非常適用于中樞神經系統的基因治療.因為服用RU486后,
其很容易通過血腦屏障,在臨床中可以安全使用.
4 RU486調控系統的應用
1 RU486調控系統在單純皰疹病毒載體(HSV)中的調控
Oligino[5]等將RU486系統引入無復制能力HSV載體中,lacZ為目的基因的
目的基因區(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶位點,反式
作用調控區(VP-GL)置入同1載體的糖蛋白C位點,構建成HSV重組病毒
GVHLZ.在病毒轉染Vero細胞24h后,他們發現如果不給RU486,lacZ表達很
低;若將細胞培養在含10-7mol/L的RU486基質中時,lacZ就會大量表達.并且,
10-7mol/L的RU486即可使目的基因表達達最大.將GVHLZ注入SD大鼠海馬
后12和36h,給予RU486或生理鹽水作對照,48h后處死大鼠取出海馬進行檢
測,Oligino發現lacZ表達比對照組高達150倍.
2 RU486調控系統在腺病毒載體(Ad)中的調控
Magnus等[6]首次將RU486系統引入重組腺病毒載體中,CAT作為報告基因
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與p17x5-TATA結合插入Ad中形成AdG5TripCAT,反式作用調控區插入Ad形
成Ad5dl309,將兩者共轉染HeLa細胞.他們在轉染開始給予RU486后16h用
ELISA法檢測CAT的表達,發現CAT的表達隨RU486給予量增加而逐漸增大,
當RU486達4umol/l時CAT達最大.
2004年,錢程[7]等成功構建出RU486調控并攜帶IL12的第3代腺病毒,并
將其進行了體外及體內的實驗驗證,發現RU486可以誘導和調控IL12的表達,
這種誘導呈劑量依賴性變化,并且在調整RU486的給藥間隔和重復給藥,IL12
的表達也會隨其波動變化或維持在1定水平,RU486調控系統的基因開關作用
表現完全.最近,Schillinger[8]等也將RU486誘導調控系統引入到高血壓的基因
治療,將RU486調控系統控制的心房利尿肽(ANP)插入到第3代腺病毒載體
中,從而實現了對ANP表達的劑量和時程控制.并且第3代腺病毒的超大容量,
低免疫源性和低細胞毒性等優點使得這1系統更加完美.
3 RU486調控系統在果蠅中的調控
Gregg Roman[9]等利用RU486調控系統對轉入果蠅的目的基因進行時間和空
間的調控.他們將RU486調控系統插入到P{Switch}放大檢測元件構成的質粒注
入果蠅胚胎中,待果蠅4天大時給予RU486飲食.結果發現通過RU486基因開
關可以對目的基因進行時序上的調控,在給予RU486飲食后1h即可得到非常高
濃度的表達,3h后指示針可以檢測到目的基因的活力.并且RU486的給予不會
引起任何的不良反應,它不會增加果蠅的致死率,也不會影響果蠅的趨光性,趨
地性和逃避反應等行為,僅有基因開關的誘導功能.Osterwalder[10]等則利用
RU486調控系統對組織特異性的基因表達進行調控,發現在果蠅胚后期,RU486
調控系統可以調控幼蟲神經肌肉接頭突觸前后的轉基因表達.
4 RU486調控系統在轉基因動物中的調控
2005年Bo等[11]又將RU486誘導調控系統轉入到轉基因大鼠體內,通過控
制RU486的給予觀察轉基因大鼠心內轉基因的表達.他們使用心臟特異性α肌
球蛋白重鏈(αMHC)啟動子調控GLP65系統,將含有反式作用調控區的載體
注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65轉基因大鼠,然后同樣方法得到
含人生長激素目的基因區(17X4-tk-hGH)的轉基因大鼠,兩者雜交得到雙重轉
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基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天給大鼠腹腔內注射RU486(500ug/kg)
觀察.結果發現不給予RU486,hGH的表達始終處于很低的基礎值;而隨著RU486
的不斷給予轉基因大鼠的hGH呈劑量依賴性表達,但在停藥后7天內轉基因表
達即可降至基礎水平;對于單轉基因αMHC-GLP65大鼠,給予RU486后未發現
任何表型出現.并且他們還首次報道,這1調控系統的作用對于任何年齡的大鼠
都可適用.
5 其他的基因開關
目前基因開關的種類已經有很多,如4環素調控系統,甾體激素,免疫抑制
劑,β-D-異丙基硫代半乳糖苷,FK1012細胞膜調控系統等等.雖然這些調控系
統各自有各自的應用范圍和優點,但是其中有些可能會激活其它的內源基因,如
FK1012細胞膜調控系統,它是運用1種免疫抑制劑FK506的2聚體FK1012,
通過激活細胞酪氨酸激酶途徑來調控基因表達,因此由于細胞膜受體激酶級聯反
應干預多種內源基因的表達,所以這1系統無法調控特異的目的基因[2].有些效
力較低,或者在動物和人轉基因運用中毒性較大(β-D-異丙基硫代半乳糖苷).
4環素調控系統則由于4環素在骨與其他組織的清除率較慢而引起關注.
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