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博萊霉素誘導大鼠肺纖維化過程中羥脯氨酸及氧化應激指標
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【Abstract】 AIM: To discuss the changes of hydroxyproline and the role of oxidationantioxidation disequilibrium in pulmonary fibrosis induced by bleomycin (BLM) in rats. METHODS: A single dose BLM was intratracheally injected to induce pulmonary fibrosis in rats, so as to observe the changes of tissue hydroxyproline and oxidativestress markers during the process. The animals were killed on the 3rd, 7th, 14th and 28th d separately. The pathological model was evaluated by HE and Masson dyeing method, and the hydroxyproline of lung tissue was determined. At the same time, malonaldehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity, reduced glutathione/oxidized glutathione (GSH/GSSG) ratio of lung tissue were also detected. RESULTS: From 7 d to 28 d, the hydroxyproline of lung tissue was increased in BLM groups compared with that in control groups, especially on the 28th d (P<0.05). On the 7 d and14 d, the tissue MDA were enhanced while the activity of SOD was decreased compared with those of control (P<0.05). The GSH/GSSG ratio was lower than that of control on the 3 d and 7 d (P<0.05). CONCLUSION: Tissue hydroxyproline can be a marker of BLMinduced pulmonary fibrosis. The oxidationantioxidation disequilibrium of cells and matrix may play a role in the pathological process.
【Keywords】 pulmonary fibrosis; hydroxyproline; oxidativestress
【摘要】 目的：觀察博萊霉素誘導的肺纖維化模型中組織羥脯氨酸(Hyp)及各氧化應激指標的變化，探討氧化抗氧化失衡在該病發生發展中的作用. 方法：二級SD大鼠40只，隨機分為模型組與對照組，每組20只. 氣管內注入博萊霉素A5（BLMA5）溶液，建立肺纖維化模型. 分別于3，7，14和28 d每組隨機抽出5只，處死后取肺臟行HE, Masson染色鑒定模型并測定Hyp含量. 同時分別以八木國夫熒光法測定肺組織脂質過氧化產物（MDA）；改良鹽酸羥胺法測定組織總超氧化物歧化酶（SOD）的酶活力；改良熒光法測定還原型谷胱甘肽（GSH）含量；熒光法測定氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量. 并計算GSH/GSSG值. 結果：成功建立博萊霉素誘導的肺纖維化模型. 各指標在不同時間點出現變化. 模型組Hyp含量于7 d時高于對照組，28 d達到最高（P<0.05）. 模型組MDA含量隨時間延長而增加，其中14 d時顯著高于對照組（P<0.05），但在28 d時有下降. SOD活力在7 d, 14 d均降低，28 d時上升. 模型組GSH/GSSG在3 d, 7 d顯著低于對照組（P<0.05），14 d, 28 d又回升. 結論：Hyp可作為博萊霉素誘導的肺纖維化的一個指標. 博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化伴有氧化損傷，且在不同階段細胞內、外的氧化抗氧化出現失衡.
【關鍵詞】 肺纖維化；羥脯氨酸；氧化應激
0引言
肺纖維化是一組由多種病因所引起的肺破壞性疾病,目前的治療方法尚不能改善其不良的預后，加強對肺纖維化機制的研究，并在此基礎上發展新的治療策略已成為更加迫切的現實需要. 一般認為，在肺部，損傷組織及激發纖維化的主要病理機制在于炎癥和免疫反應，但是大量研究表明，氧自由基在炎癥和免疫介導的組織損傷中扮演了重要角色［1］. 故本研究通過建立博萊霉素誘導的肺纖維化模型，觀察各氧化指標在此過程中的變化，從自由基理論的角度，深入探討氧化抗氧化失衡在該病發生發展中的重要作用.
1材料和方法
1.1材料
博萊霉素A5，天津太河制藥有限公司產品（批號：030305），8 mg/支. 丙二醛（MDA）標準品（Merk公司）;2Thiobarbituric acid（Merk公司）;磷鎢酸（中國醫藥集團上海化學試劑公司）;鹽酸羥胺（AR, 天津化學試劑一廠）;氯化硝基四氮唑藍，NBT，NEMI（華美公司）;Triton X100（上海試劑一廠）; 7210分光光度計(上海分析儀器廠虹橋分廠);970CRT熒光分光光度計（上海分析儀器總廠）;GL20A全自動高速冷凍離心機（湖南儀器儀表離心機廠）.
二級SD大鼠40只，雄性，體質量180~240 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供. 隨機分為模型組與對照組，每組20只.
1.2方法
1.2.1制備模型［2］以10 g/L戊巴比妥鈉（10 mg/kg, ip）麻醉大鼠，取仰臥固定位，常規消毒，行頸部正中切口，鈍型分離暴露氣管，于氣管軟骨環間隙穿刺注入BLMA5生理鹽水溶液0.2～0.3 mL（5 mg/kg），立即將動物直立并行旋轉，縫合皮膚，待動物自然清醒后置籠內常規飼養. 對照組(假手術組)以等容量生理鹽水(NS)注入氣管代之.
1.2.2模型鑒定分別于氣管內滴藥后第3，7，14和28日處理. 每批每組隨機抽出5只，麻醉處死. ①剖開胸腔及頸部，分離氣管和肺臟，結扎后取出肺臟，洗去血漬，去除結締組織，吸干水分；②從氣管插管至左主支氣管，結扎固定. 分離結扎右主支氣管后離斷，取右上葉置體積分數為40 g/L甲醛中固定1 wk，行HE和Masson染色［3］.
1.2.3肺臟羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量測定參考楊陟華等［4］的方法，將肺組織樣品剪碎，置于磨口試管中，用6 mol/L HCl (W∶V＝1∶4)水解(125℃) 3 h后，稀釋至10 mL，過濾. 取濾液0.1 mL(空白管和標準管分別用蒸餾水和標準Hyp代替)加蒸餾水到1.0 mL，充分氧化，加入0.5 mL檸檬酸緩沖液(0.25 mol/L，pH 6.0)和1.0 mL氯胺T溶液(0.05 mol/L)后6 min，用過氯酸(3.15 mol/L，1.0 mL)終止反應(靜置5 min). 加入100 g/L PDMAB 1.0 mL，于80℃水浴中保溫10 min，顯色完全后，自來水(25℃)冷卻5 min. 最后用7210分光光度計在560 nm波長比色，測量其吸光度A值，用下式計算Hyp含量：肺組織Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A樣/A標)／m. 其中，A樣為樣品管吸光度，A標為標準管吸光度，m為肺重.
1.2.4氧化損傷指標的測定剪取左肺，稱質量，按1∶5加入生理鹽水制備勻漿. 3000 r/min離心10 min，取上清，凍存備用. 分別以八木國夫熒光法［5］測定肺組織脂質過氧化產物（MDA）；改良鹽酸羥胺法［6］測定組織總SOD的酶活力；改良熒光法［7］測定還原型谷胱甘肽（GSH）；熒光法［7］測定氧化型谷胱甘肽(GSSG). 并計算GSH/GSSG值.
統計學處理：數據均以x±s表示. 采用SPSS 11.0統計軟件包進行分析，采用成組t檢驗，方差不齊時用t′檢驗. P<0.05為有顯著性差異.A: Control groupHE ×100; B: BLM groupHE ×100; C: Control groupMasson ×100; D: BLM groupMasson ×100.
2結果
2.1大體形態觀察對照組雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好. 模型組3 d未見有明顯改變，而7 d見雙肺有點狀出血、灶狀瘀斑. 14 d雙肺色澤暗淡，局部見大小不等結節樣改變，仍有陳舊出血點. 28 d雙肺呈灰白色，硬度增加，體積縮小. 表面有條索樣凹溝.
2.2光鏡觀察對照組各觀察點均未出現明顯病變. 模型組3 d時出現炎性細胞浸潤等急性肺泡炎改變；7 d時肺泡間隔增厚，大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞開始增多；14 d時肺泡炎仍較重，纖維組織進一步增加；28 d炎癥較前減輕，肺纖維化程度加重，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細胞、淋巴細胞所占據(Fig 1).
2.3肺臟Hyp含量（Fig 2）模型組Hyp含量于7 d時高于對照組，28 d達到最高（P<0.05）.
2.4肺組織勻漿MDA含量、SOD活力、GSH/GSSG比值變化（Tab 1~3）各指標在不同時間點出現變化. 模型組MDA含量隨時間延長而增加，其中14 d時顯著高于對照組（P<0.05），但在28 d時有下降. SOD活力在7 d和14 d均降低，28 d時上升. 模型組GSH/GSSG在3 d和7 d顯著低于對照組（P<0.05），14 d和28 d又回升.表1兩組大鼠肺組織勻漿MDA含量變化（略）表2兩組大鼠肺組織勻漿SOD活力變化（略）表3兩組大鼠肺組織勻漿GSH/GSSG比值變化（略）
3討論
活性氧（ROS, Reactive oxygen species） 如超氧陰離子及過氧化氫是多種疾病的重要介質，包括肺纖維化. 在正常的生理條件下，自由基引發的組織損傷可被內源性抗氧化物質所抑制. 然而，當這些抗氧化物不足以對抗大量的氧化物即氧化抗氧化系統失衡時，組織就會發生不可逆性損傷［8］. 博萊霉素與鐵離子反應可以產生ROS從而損傷蛋白、脂質和DNA，其誘導的肺纖維化包括兩個階段. 早期的炎癥階段，大量的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞浸潤到間質或肺泡中［9］. 在隨后發生的纖維化階段，炎癥細胞轉移到肺部后，因被激活釋放過量的氧自由基，除直接引起肺組織的脂質過氧化，啟動PF前的炎癥反應，尚可能通過激活核因子κB(NFκB)上調細胞因子的產量，間接促進纖維化的形成［10］；同時，肺纖維化的動物模型或患者中抗自由基的保護系統功能也有所降低. 據此，提出抑制自由基的產生，清除已產生的自由基及加強抗自由基系統的策略.
本實驗應用博萊霉素復制大鼠肺纖維化模型，觀察發現7 d時肺泡炎明顯，28 d形成纖維化，且模型組28 d時羥脯氨酸含量顯著高于對照組（P<0.05）. 主要病變與指標都與文獻一致，說明動物模型復制成功. Hyp是機體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13%,其他除彈性蛋白含有少量Hyp(約1%)外，均不含Hyp. 因此組織中Hyp含量可作為其膠原組織代謝的重要指標［11］. 本研究還發現作為體內脂質過氧化指標的MDA 14 d時與對照相比較顯著增高（P<0.05），而GSH/GSSG比值在3 d和7 d時有顯著降低，其他時間組未見明顯變化. 對照組、模型組總SOD活力在7 d和14 d時都有所降低. 以上結果提示，肺組織氧化與抗氧化指標在不同時間點出現不同的變化，作為細胞內最豐富的抗氧化劑，GSH在細胞清除ROS過程中發揮關鍵作用，尤其在肺纖維化早期炎癥階段大量耗竭；MDA含量和SOD活力在纖維化階段有所變化，推測在成纖維細胞過度增殖并分泌大量膠原的過程中，SOD可能發揮一定抑制作用. 而據文獻報道，胞外SOD是肺組織的主要抗氧化劑，它分布于細胞表面及胞外基質中，對于保護肺泡細胞及抑制基質的過度重建有重要作用［11］. 因此，研究如何調控細胞基質細胞間氧化/抗氧化系統的平衡等肺纖維化的發生機制，為防治肺纖維化的發生、發展提供新的思路.
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