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單分子光鑷技術(shù)對生命科學(xué)的應(yīng)用論文
眾所周知，大多數(shù)宏觀的生物過程是由最基本的單個蛋白酶與單個DNA分子或RNA分子之間的反應(yīng)來完成的。伴隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的進步，生命研究日益向微觀層次深入并進入后基因時代，人們不再滿足于過去只對生物體中大量分子平均行為的研究，更傾向于從單分子水平解讀生物大分子的動力學(xué)細(xì)節(jié)。利用單分子技術(shù)研究生物學(xué)問題，尤其是針對蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用的動態(tài)過程分析是近年國際上新興的研究方向。目前，單分子技術(shù)主要分為兩大類。一類基于熒光體系的單分子技術(shù)，主要包括單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（singlemoleculefluorescencereso—nanceenergytransfer，smFRET）[1]、熒光相關(guān)譜技術(shù)（fluorescencecorrelationspectroscopy，F(xiàn)CS）[2]和隨機光學(xué)重建顯微鏡技術(shù)（stochasticopticalreconstruc—tionmicroscopy，STORM）[3]等。以STORM為例，它采用光轉(zhuǎn)換熒光探針（photo—switchablefluorescentprobes），可以在時間尺度上分離相互重疊發(fā)光的熒光分子，從而得到10~20nm高分辨率的三位重構(gòu)圖像[3—5]。而傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)由于受衍射極限的限制，分辨率都在幾百個納米的水平。STORM技術(shù)還可以在納米層次上揭示細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用及組織內(nèi)細(xì)胞間的相互作用。相信隨著STORM技術(shù)的進一步發(fā)展，這一技術(shù)將被廣泛應(yīng)用到DNA、蛋白質(zhì)分子以及大分子復(fù)合體的研究[6]。另一類單分子技術(shù)則基于力學(xué)測量體系建立，主要以原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope，AFM）、磁鑷及光鑷技術(shù)為代表[7]。如圖1所示，這三種技術(shù)分別利用機械臂、磁學(xué)和光學(xué)的方法來對研究對象施加作用力[7]。因此，它們所能達(dá)到的分辨率不同（表1[8]），其中以光鑷技術(shù)為最高，其空間和時間分辨率分別可以達(dá)到0。2nm（小于1個DNA堿基對的長度）和次毫秒級，同時，光鑷是通過激光實現(xiàn)對研究對象的非接觸捕獲的，力均勻地施加在整個研究對象表面，不會像AFM一樣對研究對象造成機械損傷。由于光鑷技術(shù)超高的分辨率，應(yīng)用光鑷可以直接連續(xù)追蹤單個生物大分子折疊和去折疊的完整過程，實時測量力、距離、時間及中間態(tài)等動力學(xué)信息[8]，極大地滿足了人們從分子結(jié)構(gòu)角度剖析生物分子工作機制的需求。
近三十年來，單分子光鑷技術(shù)逐漸趨于成熟，物理學(xué)家通過改進光學(xué)硬件配置，發(fā)展新的實驗方法（差分探測法[9]）等，由單光鑷、雙光鑷[10]到多光鑷，由線性光鑷、旋轉(zhuǎn)光鑷、全息光鑷[11]到納米光鑷[12—13]，大大提高了光鑷的測量精度和廣度，這也預(yù)示著光鑷技術(shù)具有不可估量的發(fā)展前景和廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。本文將首先介紹單分子光鑷技術(shù)的基本原理和裝置，并結(jié)合實驗室的研究方向，介紹有關(guān)光鑷的基本實驗設(shè)計、光鑷在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，最后對光鑷的發(fā)展前景進行展望。
1光鑷基本原理
光是一種電磁波，在與物質(zhì)相互作用時不僅會發(fā)生能量的傳遞，也會發(fā)生動量的傳遞，也就是說光會對該物質(zhì)施加一定的力，即產(chǎn)生光的力學(xué)效應(yīng)。1970年，A。Ashkin首次提出光輻射壓力（光壓）可以操縱微小微粒[14]。1986年，A。Ashkin和Chu等實驗發(fā)現(xiàn)，只需要一束高度聚集的激光，就可形成穩(wěn)定的三維光學(xué)勢阱以穩(wěn)定俘獲微粒[15]，由于只使用了一束激光，所以稱之為單光束梯度力光阱，簡稱光鑷。光鑷是基于光的輻射力建立的。如圖2所示，在折射率為n2的介質(zhì)中存在一個折射率為n1的微粒（n1>n2），當(dāng)一束帶有動量P1的激光穿過該微粒時，經(jīng)兩次折射后，激光的動量變?yōu)镻2。根據(jù)動量守恒定律，微粒將產(chǎn)生與激光的動量變化大小相等、方向相反的動量，即Δp。由動量與沖量的關(guān)系和牛頓第二定律可知，微粒會受到一等于動量變化率的作用力，因此，當(dāng)我們采用高數(shù)值孔徑（NA>1）[15]的物鏡將激光聚焦到一個焦點f（捕獲中心）時，不論微粒上、下、左、右、前、后偏離激光焦點f，微粒都會受到一個指向焦點的作用力。這個焦點就如同一個“陷阱”可以捕獲該微粒，因此在光鑷實驗中，我們通過調(diào)節(jié)激光的位置就可以像一把無形的“鑷子”達(dá)到操控微粒的目的。同時，微粒偏離捕獲中心的距離和其受到的回復(fù)力成正比[16]，這決定了光鑷對微粒的操控不是剛性的，而是類似于“彈簧”，并符合胡克定律F=–kΔx。其中，F(xiàn)是拉力，k是光鑷的剛度系數(shù)（stiffness），Δx是微粒偏離激光中心的位移。通過微粒產(chǎn)生位移和激光的剛度系數(shù)即可計算出拉力F。因此，在操作過程中，我們可以通過實時測量微粒的位移得到微粒間的相互作用力，從而得到與微粒相連的生物分子上所受的作用力。
2光鑷實驗設(shè)計
光鑷技術(shù)的實驗環(huán)境一般為接近于生理環(huán)境的水溶液，可減少對樣品的損傷，同時實現(xiàn)在生物分子具有生理活性的條件下實時監(jiān)測分子動態(tài)行為的目的。此外，如何對樣品進行處理是光鑷實驗設(shè)計中的另一個關(guān)鍵問題。由于生物分子，例如DNA、蛋白質(zhì)等，往往在幾納米到幾十納米之間，光鑷的剛度一般不能穩(wěn)定地捕獲和操控生物分子，因此需要借助一個表面修飾的微米量級的小球（微球）作為“手柄”，將生物樣品通過化學(xué)偶聯(lián)黏附在微球上，通過直接操控微球達(dá)到間接操控生物分子的目的[17]。生物大分子尤其是蛋白分子，通常尺寸較小，因此會在生物分子的一端或兩端通過化學(xué)方法交聯(lián)上一段或兩段DNAHandle[18]，使得生物分子兩側(cè)的微球間有足夠的空間距離，方便對單個生物分子進行力的測量并且減少微球間不必要的相互作用；選用的DNAHandle分子長度一般大于500bp[8]。圖2是雙光鑷技術(shù)研究生物樣品的經(jīng)典單分子實驗體系[19]示意圖（以DNAHairpin為例），兩個聚苯乙烯小球表面分別免疫修飾了Streptavidin和anti—Digoxigenin，DNAHairpin一端被標(biāo)記biotin與Streptavidin修飾的微球相連，另一端則通過巰基與DNAHandle共價交聯(lián)；DNAHandle則通過Digoxigenin與修飾anti—Digoxi—genin的微球相連。因此，當(dāng)我們利用兩束激光分別捕獲兩個微球時，就可以對微球間的conjugates進行操作，通過移動光阱的位置，微球間的距離和力都會發(fā)生改變，我們通過測量這些數(shù)據(jù)就可以得到相關(guān)的動力學(xué)信息。
3光鑷技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用
近年來，基于光鑷技術(shù)的應(yīng)用研究，證實了該技術(shù)獨到的應(yīng)用價值。光鑷的應(yīng)用基本分為四類，即光鑷與細(xì)胞生物學(xué)、光鑷與單分子生物學(xué)、光鑷與軟物質(zhì)膠體科學(xué)和光鑷與物理學(xué)四個領(lǐng)域。在這些領(lǐng)域中，科學(xué)家們利用光鑷技術(shù)解決了許多重要的科學(xué)問題。結(jié)合我們實驗室的研究方向，我們將主要對光鑷在單分子生物學(xué)的應(yīng)用加以介紹。光鑷亞納米級的空間分辨率和飛牛頓的力分辨率使其在研究一些生物大分子（如DNA/RNA雙鏈特性[20—22]、分子馬達(dá)的分子機制和生物學(xué)功能[17，23—24]、蛋白質(zhì)折疊[25—27]以及染色質(zhì)重塑[28]等）的動態(tài)運動細(xì)節(jié)（中間態(tài)、能量、折疊速率、作用力、距離等）方面成為一項不可或缺的單分子技術(shù)，并展示出巨大的發(fā)展前景。以下我們將對一些代表性的研究成果進行簡要介紹。
3。1研究DNA力學(xué)性質(zhì)
現(xiàn)代生物學(xué)中一個最基本的生物學(xué)定律就是中心法則：即遺傳信息可由DNA流向DNA，完成DNA的自我復(fù)制過程；也可由DNA流向RNA再進一步流向蛋白質(zhì)，完成轉(zhuǎn)錄翻譯過程。這是構(gòu)成現(xiàn)代生物學(xué)的理論基石，因此，DNA、RNA與蛋白質(zhì)的特性以及它們之間的相互作用無疑是整個生物學(xué)研究的核心。Bustamante等[29]首先利用單分子磁鑷技術(shù)操縱長約16μm的dsDNA分子，測量了DNA的拉伸特性：在0。1~10pN范圍內(nèi)，DNA的拉伸行為符合蠕蟲鏈模型（worm—likechain，WLC），持久長度為50nm；而當(dāng)力增加到65pN時，DNA的結(jié)構(gòu)由B型變成S型[30—31]；人們用同樣的方法研究了ssDNA的力學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與dsDNA的拉伸曲線截然不同，ssDNA的持久長度僅有1nm�；谶@些實驗結(jié)論，科學(xué)家們就可以通過研究蛋白質(zhì)對DNA拉伸特性的改變來研究DNA相關(guān)蛋白（如RNA聚合酶、核糖體、DNA異位酶等）的工作機制。細(xì)胞分裂時，DNA會發(fā)生凝縮形成高度聚集結(jié)構(gòu)以維持遺傳信息的穩(wěn)定性。之前人們對DNA如何形成核小體結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了一定的認(rèn)識，但是對更高級的染色體結(jié)構(gòu)形成缺乏了解。Case等[32]利用光鑷技術(shù)將參與高級染色體結(jié)構(gòu)形成的凝聚蛋白MuK—BEF作為研究對象解析了這一動態(tài)凝聚過程。Case等發(fā)現(xiàn)，與nakedDNA的力–延伸曲線（force—extensioncurve，F(xiàn)EC）相比，MuKBEF—DNA復(fù)合體表現(xiàn)出更大變化率的力–延伸曲線（FEC），并且當(dāng)拉力達(dá)到17pN時，MuKBEF—DNA復(fù)合體會經(jīng)歷一個鋸齒狀振蕩的平坦曲線，說明MuKBEF—DNA復(fù)合體經(jīng)歷了個別凝聚事件（MuKBEF結(jié)合到DNA上時利用“夾子”這種張合的方式來凝聚DNA）。而當(dāng)力被撤回時，MuKBEF—DNA復(fù)合體重新回到原始的凝聚態(tài)，Case等根據(jù)這一現(xiàn)象提出了MuKBEF復(fù)合物凝縮DNA的“夾子”模型，這一研究為DNA凝縮機制的研究提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
3。2研究分子馬達(dá)的運動機制
生物機體的一切活動，從DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂、肌肉收縮到細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，最終都?xì)w結(jié)為分子馬達(dá)做功的結(jié)果。分子馬達(dá)通過運動可以快速高效地將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動能，執(zhí)行各種生物功能，因此，分子馬達(dá)的動力學(xué)機制成為研究者們關(guān)注的焦點。科學(xué)家利用光鑷觀察了分子馬達(dá)運動過程，發(fā)現(xiàn)分子馬達(dá)是以步進形式運動的，并測量了蛋白的運動步長，證明了單個驅(qū)動分子的力和運動速度與ATP濃度相關(guān)[17，23，33—34]。這些研究使得光鑷成為研究單酶動力學(xué)的重要手段，促使科學(xué)家利用光鑷技術(shù)研究表觀遺傳調(diào)控機制，尤其是ATP依賴的染色體重塑復(fù)合物的運動機制[35]�；蚪MDNA通常以染色質(zhì)的形式存在于細(xì)胞中，以維持遺傳信息的穩(wěn)定性。然而很多細(xì)胞生命活動（比如基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、DNA重組等）的正常進行都需要不同的DNA結(jié)合蛋白或者反式作用因子結(jié)合到特定的DNA區(qū)域（如啟動子、增強子等順式作用元件），進而發(fā)揮功能，因此需要染色質(zhì)重塑蛋白復(fù)合物移動、驅(qū)逐和重組核小體使得染色質(zhì)DNA從核小體上暴露出來。目前，光鑷研究染色體重塑復(fù)合物的工作已經(jīng)取得了一定的進展。Bustamante實驗室利用光鑷成功操作單個核小體并研究核小體動態(tài)行為，發(fā)現(xiàn)在2~3pN的力作用下，核小體上外圍DNA與組蛋白八聚體的相互作用會被打破，而內(nèi)部DNA與組蛋白的相互作用被打破則需要20pN以上的力[36]。Zhang等[37]則利用光鑷在核小體水平實時監(jiān)測了RSC復(fù)合物的作用，測定了RSC轉(zhuǎn)移速率等動力學(xué)參數(shù)，證實了RSC是依賴核小體的轉(zhuǎn)移酶。Hall等[38]發(fā)現(xiàn)，核小體中DNA—組蛋白相互作用并不是均勻的，在空間上存在約5bp的周期，有3個強的作用區(qū)域，其中dyad區(qū)域的作用最強，另兩個較強的作用區(qū)域在離dyad約±40bp處，而核小體的進出端的相互作用較弱，這些強弱不同的相互作用形成了不同的能壘。這些能壘可能對染色體重塑復(fù)合物有著重要的影響，因為染色體重塑時可能需要克服核小體上的能壘，這些參數(shù)為以后染色體重塑復(fù)合物具體工作機制的研究提供了很好的參考。
3。3研究蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)機制
光鑷在單分子生物學(xué)的另一個重要應(yīng)用就是研究蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)過程。在蛋白質(zhì)折疊研究中，人們往往最關(guān)心的問題就是一維的氨基酸序列以何種方式折疊而變成穩(wěn)定的有功能的三維結(jié)構(gòu)的。眾所周知，蛋白質(zhì)的折疊態(tài)、去折疊態(tài)及錯誤折疊態(tài)在生物體系中都同時存在。這些態(tài)與態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換和生物體系的功能直接相關(guān)，同時也和疾病的形成有著密切的關(guān)系[8]。盡管人們已經(jīng)利用各種傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法對蛋白質(zhì)反折疊過程進行了幾十年的深入研究，但對蛋白質(zhì)折疊過程中的具體動力學(xué)細(xì)節(jié)仍知之甚少。光鑷技術(shù)可以對操控單個蛋白分子并實施觀測整個折疊和去折疊的動力學(xué)過程，因此被越來越多地應(yīng)用到研究生物物理的精細(xì)過程研究。最近，Gao等[26]利用雙光鑷技術(shù)對突觸SNARE蛋白的組裝機制進行了深入研究。在神經(jīng)細(xì)胞分泌過程中，SNARE蛋白介導(dǎo)突觸小泡與突觸前膜的融合。SNARE蛋白包括定位在靶細(xì)胞膜上的t—SNARE（syntaxin和SNAP—25）和囊泡膜上的v—SNARE，只有當(dāng)t—SNARE和v—SNARE通過組裝形成“拉鏈?zhǔn)健睆?fù)合物時才能驅(qū)動膜融合。盡管過去的二十年已經(jīng)做了大量研究，但是“拉鏈?zhǔn)健奔僬f、裝配中間體、動力學(xué)和能量仍然不明。Gao等通過實時觀測單個SNARE復(fù)合體的組裝/去組裝過程，發(fā)現(xiàn)了SNARE復(fù)合體的“拉鏈?zhǔn)健苯Y(jié)構(gòu)和關(guān)鍵的“半拉鏈?zhǔn)健毖b配中間體（t—SNARE和v—SNARE部分折疊到“離子層”），提出了一種效率高的“拉鏈?zhǔn)健苯M裝模型，即：SNARE復(fù)合體N末端的“拉鏈?zhǔn)健苯M裝是緩慢的，從而SNARE裝配中間體可以充當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白（如Munc18和Complexin）的結(jié)合平臺，然后在調(diào)節(jié)模式下，進一步穩(wěn)定地裝配中間體快速及強有力地進行“拉鏈?zhǔn)健苯M裝直到C末端，最終在跨膜區(qū)驅(qū)動膜融合。此外，Zhang實驗室還研究了SNARE突變體、Munc18和Complexin對SNARE組裝/去組裝動力學(xué)過程的影響[39]。該研究成果從分子水平上加深了人們對神經(jīng)分泌過程中SNARE蛋白復(fù)合體驅(qū)動融合機制的深入了解，同時為我們探索更多疾病相關(guān)性蛋白的動力學(xué)機制提供了很好的模式基礎(chǔ)，相信我們可以通過光鑷技術(shù)從生物物理層面解釋某些蛋白與疾病形成的關(guān)聯(lián)，為開發(fā)抗癌藥物提供更精確的結(jié)構(gòu)水平的信息。
4光鑷與其他技術(shù)相結(jié)合
以上關(guān)于光鑷技術(shù)應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究僅僅是冰山一角，但已經(jīng)向我們展示了光鑷在單分子水平研究生物大分子動力學(xué)的優(yōu)越性，它的應(yīng)用極大地推動了生命科學(xué)尤其是生物物理學(xué)的發(fā)展，加速了人們從單分子水平解析DNA、蛋白質(zhì)以及各種酶反應(yīng)的動力學(xué)過程。然而每項實驗技術(shù)都有其一定的局限性，這就需要相關(guān)技術(shù)手段結(jié)合，克服彼此的劣勢，達(dá)到最理想的功效。光鑷也常常與其他光學(xué)技術(shù)相結(jié)合，成為性能更優(yōu)越的技術(shù)手段。
4。1光鑷與smFRET技術(shù)結(jié)合
生物大分子尤其是蛋白質(zhì)往往是三維結(jié)構(gòu)，但目前光鑷僅能在一維空間研究它們結(jié)構(gòu)動力學(xué)（沿光阱移動方向），存在一定的局限性。例如，馬達(dá)蛋白沿底物移動時會經(jīng)歷復(fù)雜的分子內(nèi)構(gòu)象改變，超高分辨率光鑷僅能研究馬達(dá)蛋白沿底物移動的步長等動力學(xué)信息，而無法獲知蛋白的具體構(gòu)象變化過程。smFRET技術(shù)即單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測技術(shù)，則可通過給生物分子的不同結(jié)構(gòu)域，或者相互作用的分子，比如受體與配體上分別標(biāo)記donor和acceptor的染料分子，實時地觀測分子構(gòu)象的變化過程，但其空間分辨率不高。因此，為實現(xiàn)在亞納米級的空間尺度上研究生物分子構(gòu)象變化的目的，科學(xué)家們采用交錯分時的方法（interlacingandtimesharingmethod）將smFRET與光鑷技術(shù)相結(jié)合，并利用ssDNA與其互補序列的雜交過程證明了該方法的可行性[40]。相信隨著這種整合儀器設(shè)備的進一步完善，科學(xué)工作者將會通過熒光信號和成像技術(shù)在單分子、亞納米級空間尺度上多角度監(jiān)測生物分子的構(gòu)象改變，尤其是一些蛋白復(fù)合物和大分子機器，得到更多的動力學(xué)信息。
4。2光鑷與拉曼光譜結(jié)合
當(dāng)一束單色光通過振動的分子時會發(fā)生非彈性散射，入射光的能量變化與分子內(nèi)部分子鍵（molecularbond）的振動能量相一致，收集分子對入射光的拉曼散射光譜，就可以判斷分子的生物化學(xué)組成[41]。傳統(tǒng)共聚焦顯微拉曼光譜的后向散射橫切面很小，散射強度十分微弱，因此所得到的拉曼信號很弱，同時拉曼光譜探測技術(shù)通常使用化學(xué)修飾將研究對象固定在機制上，這種配置非常不利于生物分子維持其天然的生理狀態(tài)，也不利于背景噪聲的去除。而結(jié)合光鑷技術(shù)的激光光鑷?yán)庾V系統(tǒng)（lasertweezersRamanspectroscopy，LTRS）則可以利用激光形成的光阱捕獲生物分子，實現(xiàn)在溶液中將其固定并同時得到光譜信號的目的，保證了生物分子天然的微環(huán)境，大大提升了光譜的信噪比[41]。近年來，激光光鑷?yán)庾V系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于不同細(xì)胞類型的分選[42]、細(xì)菌孢子[43]、囊泡等研究。不同于熒光技術(shù)，拉曼光譜的非彈性散射使其避開了光學(xué)漂白，可以實現(xiàn)實時、連續(xù)監(jiān)測單細(xì)胞的動態(tài)過程。Moritz等[44—45]利用激光光鑷?yán)庾V控制單個大腸桿菌細(xì)胞，研究其對抗菌藥物的敏感性。首先在無藥狀態(tài)下測定大腸桿菌在生長周期的不同階段與DNA、RNA及蛋白質(zhì)相關(guān)的不同拉曼振動譜帶，然后在加藥（盤尼西林/鏈霉素、頭孢唑林）狀態(tài)下測定729cm–1、1245cm–1和1660cm–1的光譜譜帶并與無藥狀態(tài)下的拉曼光譜相比較，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對頭孢唑林更加敏感。激光光鑷?yán)夹g(shù)無需樣品預(yù)處理，對樣品無損害，是臨床研究一個很好的切入點，相信隨著該技術(shù)的進一步發(fā)展，其在細(xì)胞分選、癌細(xì)胞檢測及細(xì)胞動力學(xué)單細(xì)胞水平研究上會越來越有發(fā)展空間。
5發(fā)展前景及展望
由于光鑷技術(shù)集電子、光學(xué)、計算機編程、微觀操作和生物學(xué)為一體，國際上僅少數(shù)實驗室搭建了不同形式、可操作性強的光鑷裝置，但隨著光鑷應(yīng)用日趨廣泛，光鑷的潛在發(fā)展趨勢也越發(fā)引人關(guān)注，更多的科研人員投身于光鑷技術(shù)的理論研究和應(yīng)用研發(fā)，相信在不久的將來，隨著光鑷技術(shù)日趨成熟以及與其他光學(xué)技術(shù)結(jié)合，如熒光技術(shù)、拉曼光譜、全息技術(shù)、納米孔等，光鑷這項富有活力的新興技術(shù)將會在實時連續(xù)監(jiān)測單細(xì)胞/單分子的生物動力學(xué)，細(xì)胞與細(xì)胞、分子與分子間的相互作用等生命科學(xué)領(lǐng)域做出更多貢獻。
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