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磁性納米顆粒在BMSCs中的封裝及其臨床應用論文
磁性納米材料指尺度為 1 ~ 100 nm 的磁性材料，目前以鐵系氧化物居多。磁性納米材料通常在磁性納米顆粒表面修飾上多種生物大分子或者靶的配體，這樣就既具備良好的磁導向性，也具有良好的生物相容性或者靶向性，可與多種功能分子如蛋白質、核酸和維生素等結合，實現磁靶向應用[1].磁性納米顆粒的應用主要見于： 可作為藥物載體，通過外加磁場的作用將藥物靶向定位； 可應用于磁共振成像（ MRI） 作為對比造影劑進行體內示蹤、細胞篩選、生物分離和基因治療等。Mah 等[2]將攜帶有治療基因的病毒載體包被到磁性載體的表面，當磁性載體到達靶部位時通過體外磁場使其滯留在靶部位，這樣可使病毒較長時間接觸靶組織，從而增加基因轉染和表達的效率。
1987 年 Friedenstein 等[3]首次從骨髓中分離獲得骨髓間充質干細胞（ BMSCs） ,自此 BMSCs 移植在動物實驗和臨床應用中得到了重視和發展。BMSCs 在體外特定的誘導條件下或體內特定環境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、骨髓基質、肌腱及韌帶等組織[4].
BMSCs 具有定向遷移至損傷部位進行增殖、分化并修復損傷組織的能力[5].BMSCs 取材容易，對機體損傷小，且體外培養簡單，細胞擴增速度快，由于自體移植無明顯的免疫排斥反應，也不涉及倫理道德問題，具有良好的臨床應用前景，因此，目前在組織工程、基因工程等研究中成為理想的種子細胞，在臨床疾病的治療過程中，對骨骼系統疾病、肝臟纖維化、心臟疾病的治療具有很高的價值[6].
隨著磁性納米材料技術的發展與成熟，利用 MRI標記細胞進行活體示蹤的研究成為當前熱點[7-9].研究者設想將磁性納米顆粒封裝入 BMSCs,在保證BMSCs 生物活性和分化潛能的前提下，在外加磁場的作用下，可實現 BMSCs 在機體內的靶向定位，同時因為磁性納米顆粒可作為 MRI 的對比增強劑，可以實現BMSCs 的體內示蹤，動態觀察 BMSCs 的遷移和增殖過程，將磁性納米顆粒封裝入 BMSCs,可以充分發揮兩者的優勢，因而具有廣闊的應用前景。
1 磁性納米材料和 BMSCs 的制備方法
1. 1 常見磁性納米材料制備方法
磁性納米材料一般是鐵氧化物，其制備方法通常有干法與濕法。干法是指在比較劇烈的條件下，使鐵的配合物分解以得到鐵的納米材料； 濕法包括空氣氧化法、共沉淀法、微乳液法及熱分解法。目前在有機相中用的最多的是熱分解法，在水相中則為共沉淀法。
熱分解法是指使用高沸點有機溶劑，使鐵的配合物在高溫下分解，經過氧化和部分還原得到產物[10]; 而共沉淀法是指在液相中將沉淀劑加入到含有鐵離子和亞鐵離子的溶液中，生成磁性納米顆粒。
1. 2 BMSCs 的制備方法
BMSCs 主要存在于骨髓組織中，具有貼壁生長的特性，通過全骨髓貼壁分離的方法，經多次傳代，可以獲得比較純凈的 BMSCs[11].目前制備 BMSCs 的方法主要有流式細胞儀分離法、免疫磁珠法、貼壁篩選法及密度梯度離心法等[12].其中免疫磁珠法和流式細胞儀法制得的細胞活性低下，操作繁瑣，較少使用。目前應用較多的方法是將密度梯度離心法和貼壁篩選法相結合，即通過離心使成纖維細胞和其他單核細胞分離，接種于培養瓶后，利用 BMSCs 的貼壁生長性，獲得足量的 BMSCs[12-14].
2 磁性納米材料對 BMSCs 的影響
2. 1 磁性納米材料進入 BMSCs 的過程和方法
多個實驗表明，磁性納米顆粒及細胞膜表面都帶負電荷，兩者相互排斥，這使得磁性納米顆粒在自然狀態并不能有效地被哺乳動物細胞攝取，標記率低，因此為達到磁性標記細胞的目的，必須通過修飾細胞，再經由吞噬作用、液相胞飲作用、受體介導的吞噬作用和轉染作用促進細胞對其攝取。為了將磁性納米顆粒成功導入 BMSCs,目前常用的方法是使用帶正電荷的基團包裹納米顆粒，基團必須具備生物相容性和可降解性，以避免損傷正常組織。國內學者做了不少相關工作。于春鵬[6]選用帶正電荷的轉染劑多聚賴氨酸（ PLL,0. 75 μg·ml- 1） ,它包裹帶負電荷的納米顆粒，形成兩者的聚合體，更容易穿越帶負電荷的細胞膜進入細胞。陳鵬等[10]使用葡聚糖包被的磁性納米顆粒與 BMSCs 共培養，封裝好的細胞增殖和分化能力均與對照組無明顯差異，磁性納米顆粒晶體表面包裹葡聚糖形成的核殼式結構阻止了氧化鐵顆粒水溶進程并保護細胞不受 Fe 的毒害，是當前使用比較廣泛的一種包被磁性納米顆粒的方法。陳瀛[15]用接種了氨（ Fe304-Si02-NH2） 的二氧化硅（ SiO2） 包裹磁性納米顆粒，使得細胞對磁性納米顆粒的吞噬率大大提高。金旭紅等[16]用硫酸魚精蛋白包裹磁性納米顆粒，可使納米顆粒成功進入 BMSCs,同時不影響細胞活性和分化能力。
雖然包被納米顆粒的方法很多，可以使納米顆粒成功導入 BMSCs,但是包被好的納米顆粒進入細胞的過程和方式尚不清楚，缺乏相關研究，另外不同研究中納米顆粒的性質和形態也并不統一。至于 BMSCs 攝取磁性納米顆粒的過程是否受外加磁場的影響，也未見相關報道。
2. 2 適宜的納米顆粒質量濃度和共同孵育時間
關于納米顆粒標記 BMSCs 的適宜濃度，多個研究。[10,15,17-18]報道所用納米顆粒的質量濃度有所不同。這可能是不同研究使用的納米顆粒直徑和表面包被的修飾物不同，每個實驗室的研究條件也不一樣的原因所致。張瑞平等[19]總結前人的研究成果得出納米顆粒合適的質量濃度是 20 ~50 （ μg Fe） ·ml- 1,此濃度為磁性納米顆粒的理想標記濃度，此濃度下 BMSCs 標記率高，且納米顆粒的細胞毒性及其對 BMSCs 的增殖活性影響較小。一般文獻報道中常用的超順磁性納米鐵離子（ SPIO） 標記細胞的濃度通常在 10 ~ 20 μg·ml- 1.最新研究顯示，SPIO 有效標記 BMSCs 的最低質量濃度為 15 mg·L- 1[20],在 15 mg·L- 1時，SPIO 對BMSCs 標記效率較高，且不影響其存活、增殖。但對納米顆粒和 BMSCs 共同孵育的時間基本一致，為18 ~24 h[18-20],時間過短降低了 BMSCs 的標記率，時間過長影響細胞活性。
2. 3 磁性納米顆粒和 BMSCs 結合物 （ 納米顆粒-BMSCs） 的鑒定方法
多個研究[11-15,17-18]證實，在適宜的濃度范圍內，磁性納米材料對 BMSCs 的形態、生長、遷移、成骨分化能力等無明顯影響，磁性納米材料具有良好的生物相容性。鑒定磁性納米顆粒是否成功標記 BMSCs,以及標記后 BMSCs 細胞的活性和分化能力的方法總結如下。
2. 3. 1 磁性納米顆粒成功標記 BMSCs 的鑒定方法
2. 3. 1. 1 普魯士藍鐵染色 成功標記的細胞內部可看到藍染顆粒，標記率 = 藍染細胞數/細胞總數。張旭等[17]發現，磁性納米顆粒進入 BMSCs 后主要積聚于細胞質中，可見大量藍染顆粒，部分聚集成團，顆粒分布以核周和靠近細胞膜處較為明顯，細胞核中沒有藍染顆粒。
2. 3. 1. 2 透射電鏡檢查 以正常的 BMSCs 作為對照，成功標記的 BMSCs 細胞質中可觀察到高密度電子顆粒，進入的納米顆粒越多，高密度顆粒數量越多。
2. 3. 2 磁性納米顆粒-BMSCs 生長活性的鑒定方法2. 3. 2. 1 臺盼藍染色法 將納米顆粒-BMSCs 的細胞懸液與臺盼藍染色液以 9∶ 1 的比例混勻，靜置3 min,光鏡下計數，死細胞為藍色，活細胞不著色，以正常的BMSCs 作為對照，計數 200 個細胞，計算活細胞百分比。
2. 3. 2. 2 細胞計數試劑盒（ CCK-8） 法 將標記磁性納米顆粒的 BMSCs 制成細胞懸液，外加正常細胞的空白對照組，按每孔 100 μl 接種于兩塊 96 孔板中，每組每天 3 個復孔。培養 24 h 后第 1 天測量組每孔加入10 μl CCK-8 溶液，將培養板放入細胞培養箱中繼續培養，測量標本 450 nm 處的吸光度值（ A 值） .根據公式： 細 胞 抑 制 率 = （ A實驗組- A陰性對照組） /（ A實驗組-A空白對照組） ×100%,計算納米顆粒對細胞的抑制率。
2. 3. 2. 3 測量生化指標法 乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，主要存在于機體所有組織細胞的胞質內，當細胞膜的完整性受到破壞時，胞漿內的乳酸脫氫酶會溢出，因此測定上清液中的乳酸脫氫酶活性可以很好地反映細胞膜受損傷的程度，與細胞死亡數目成正比[21].另外，也可測量超氧化物歧化酶（ SOD） 的含量來判斷細胞的活力。超氧陰離子自由基是生物體內正常的代謝產物，SOD 的主要功能是催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧，可清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受傷害，因此 SOD 值可反映細胞抵抗氧化損傷的能力[22].
2. 3. 2. 4 四甲基偶氮唑鹽（ MTT） 比色法[8,15,17,23]將納米顆粒標記的 BMSCs 的細胞懸液接種于 96 孔板，以未標記的 BMSCs 作為空白對照，用酶標儀在490 nm處側出 A 值，并與對照組對比。
2. 3. 3 磁性納米顆粒-BMSCs 分化能力的鑒定方法
2. 3. 3. 1 茜素紅染色法[23]在納米顆粒-BMSCs 組和正常 BMSCs 組中均加入成骨誘導液，觀察細胞形態的變化，分化的細胞中間可見圓形與卵圓形鈣化結節，茜素紅染色可見桔紅色鈣鹽沉積。
2. 3. 3. 2 測定 BMSCs 細胞上清液中的堿性磷酸酶活性 對不同時間段納米顆粒-BMSCs 組和正常 BMSCs組上清液按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作說明進行酶聯免疫檢測，測定 A 值，計算兩者差異有無統計學意義。
3 攝取有磁性納米材料 BMSCs 的臨床應用
3. 1 骨骼系統
3. 1. 1 椎間盤突出
Sakai 等[24]用綠色熒光蛋白標記的自體 BMSCs移植入成年家兔退變髓核中，結果顯示，植入的細胞可以增輔并且表達出一些髓核細胞的特征性表型，髓核內蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達水平明顯上調，兩者均為細胞外基質的重要組成成分。Zhang 等[25]將兔同種異體的 BMSCs 注射入兔的椎間盤，與未注射組和注射鹽水組在 1、3、6 個月時分別檢測 mRNA、蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量，結果顯示注射 BMSCs 組均明顯增加。鮑軍平等[12]以家兔為實驗對象，證實 BMSCs 對椎間盤尚未突出但髓核已改變的椎間盤同樣有效。
3. 1. 2 股骨頭壞死（ ONFH）
ONFH 是骨科常見難治性疾病，早期多用藥物和物理治療，晚期以人工關節置換為主，患者病程長、痛苦多、醫療花費大。BMSCs 具有多向分化能力，移植入體內的 BMSCs 分化后可替換已經壞死的細胞，這為ONFH 的治療提供了一種全新的思路和方法。 在ONFH 病例中，BMSCs 的數量及成骨活性均有明顯的下降[26].對 116 例壞死的股骨頭行髓芯減壓，同時抽取自體骨髓血，體外分離、濃集后植入骨壞死區域，即通過細胞移植治療 ONFH,對早期 ONFH 取得優良效果[27].孟增東等[13]證實了 SPIO 標記的 BMSCs 與未標記的 BMSCs 原位移植治療兔 ONFH 有著同樣療效。
3. 2 肝臟
BMSCs 在肝細胞生長因子的誘導下可以分化為正常肝細胞，已有報道將自體移植的 BMSCs 用于重型肝炎和晚期肝硬化的治療，取得了良好效果。于春鵬[6]用 PLL 標記的磁性納米顆粒-BMSCs,通過 MRI觀察 BMSCs 在大鼠肝纖維化模型中的定位情況，證實了 BMSCs 在大鼠體內可分化為肝細胞，同時為 BMSCs的增殖分化提供了影像學支持。
3. 3 其他疾病
張瑞平等[14]證實 BMSCs 移植對家兔急性重癥胰腺炎（ SAP） 有一定治療效果，同時通過 MRI 進行了細胞示蹤，為 SAP 提供了一種新的治療思路和方法。另外，使用不同的磁性納米顆粒標記 BMSCs,將標記細胞移植到梗死的心肌內進行 MRI 在體內顯像的研究，證明標記細胞可以在常規心臟顯影，并與組織學檢查有良好的一致性[15].這表明 BMSCs 在體內可以遷移到心臟，至于是否能順利分化為心肌細胞，什么時候分化，需要什么條件，未見相關研究報道。有研究證實BMSCs 可改善足細胞融合，促進足細胞再生，理論上為治療糖尿病腎病提供了一種新的手段[28].
4 存在的問題和未來的研究趨勢
BMSCs 的研究已經持續了 30 多年，在成功標記磁性納米材料后，通過外加磁場和 MRI 技術的應用，BMSCs 的靶向定位和體內的遷移、示蹤等問題迎刃而解，實現了對 BMSCs 的動態觀察。納米材料的引入為BMSCs 研究帶來了飛躍性發展，但同時也有很多問題仍待解決： （ 1） 該研究仍處于動物試驗階段，缺乏人體試驗的數據，應用于臨床尚需時日； （ 2） 相關的機制和作用過程仍不清楚，例如納米顆粒進入 BMSCs 的具體過程和作用機理，BMSCs 在體內的定向遷移和分化，以及如何人為控制細胞分化的過程和結果等； （ 3） 進入機體后，BMSCs 的自行分化問題； （ 4） BMSCs 中的磁性納米顆粒隨著細胞的分裂逐漸減少，漸漸失去靶向性和定位能力，影響長期觀察[24]; （ 5） 引入磁場后，正常的生理活動是否會受影響。未來的研究重點是 BMSCs 的分化過程和機制，具體的分化時機和結果，若能實現人為控制，將是向臨床應用邁出的重要一步。另外，要找到合適的方法，提高磁性納米顆粒對 BMSCs 的封裝效率，滿足可以作為長期定位和示蹤的要求。同時要引入外加磁場，觀察外磁場對納米顆粒對 BMSCs 的顆粒攝取、遷移、分化等行為有何影響，為將來細胞的靶向定位打下堅實基礎。
5 總結和展望
醫學科學研究的最終目的是應用于臨床治療。BMSCs 具有多向分化的潛能，是組織工程學的重要種子細胞； 磁性納米材料的出現，是生物材料領域的重大突破； 將磁性納米材料封裝入 BMSCs,可以充分發揮兩者的優勢，具有廣闊的發展前景。目前該項研究尚有一些問題需要解決和優化。可以預見，不遠的將來，封裝有磁性納米顆粒的 BMSCs 將會大大促進組織工程學和臨床醫學的發展，為廣大患者帶來福利。
[參考文獻]
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